En utilisant un effet non linéaire de génération de troisième harmonique (GTH)d'un faisceau laser, des chercheurs du Centre de physique moléculaire optique et hertzienne¹ (CPMOH) ont récemment mis au point un nouveau type de microscope permettant la reconstruction tridimensionnelle de l'image d'un objet. Le faisceau laser génère dans l'objet un signal que l'on détecte en transmission. L'intensitédu signal, dépendant du milieu traversé et changeant fortement aux interfaces,permet une reconstruction point par point de la structure de l'objet. Cette microscopie laser présente d'énormes avantages par rapport aux techniques existantes et utiliséespour l'étude des milieux biologiques (fluorescence à deux photons par exemple) : pour faire de l'imagerie, elle ne nécessite pas l'insertion, dans l'objet étudié,d'éléments chimiques additionnels. Elle peut s'employer aussi bien en caractérisationde matériaux qu'en biologie.

Une instrumentation à base d'optique non linéaire, parfaitement compatible avec les techniques actuelles de microscopie et dont les premiers pas technologiques datent de moins d'une dizaine d'années, sert à la recherche d'informations microscopiques fonctionnelles et dynamiques avec une bonne résolution dans le domaine des sciences du vivant.

En exploitant les compétences acquises dans la technologie des lasers à impulsions ultra courtes, les scientifiques du CPMOH ont développé un microscope à génération de troisième harmonique qui utilise ce phénomène. Cet outil transpose la technologie émergente de l'optique non linéaire dans le domaine de la biologie cellulaire et de la matière condensée. Ce projet ouvre de larges perspectives d'études des milieux vivants car, utilisant la durée extrêmement courte des impulsions laser, une faible puissance moyenne est suffisante pour obtenir l'image et limite de fait les effets thermiques.

L'encadré ci-dessous illustre les performances de l'appareil construit. Il montre l'image de cellules de diatomée et de cellules microgliales (figures 1a et 1c) avec une résolution de 0,5 µm, correspondant à la valeur théorique attendue en prenant en compte la focale et l'ouverture de l'objectif utilisé. La figure 1d présente plusieurs images de cellules microgliales embryonnaires humaines à différentes profondeurs. Ces cellules jouent un rôle de support de neurone dans le cerveau. Elles sont impliquées dans de nombreuses pathologies humaines comme la maladie de Creutzfeld-Jacob ou d'Alzheimer et sont bien connues du point de vue des canaux ioniques et des activités calcique intracellulaires. Ces images correspondent à des coupes de ces cellules à différents plans.

© CNRS-CPMOH.		Figure 1a : image par microscopie GTH d'une diatomée.
© CNRS-CPMOH.		Figure 1b : même image par une microscopie classique.
© CNRS-CPMOH.		Figure 1c : image par microscopie GTH d'une cellule microgliale embryonnaire humaine (CHME5).
© CNRS-CPMOH.		Figure 1d : images par GTH d'une cellule microgliale embryonnaire humaine faites à différentes profondeurs par pas de 0,2 µm.

La figure 2 décrit une autre application intéressante qui concerne la dynamique de diffusion du flux calcique intracellulaire. Les résultats prouvent que l'on peut directement mesurer ce flux calcique ainsi que son temps de migration. Généralement, ces études sont faites par des sondes fluorescentes qu'il est nécessaire d'injecter dans la cellule ou par des mesures de conductivité. Elles nécessitent alors une préparation qui peut altérer la réponse de la cellule par la présence des corps étrangers injectés. La méthode développée au laboratoire a l'énorme avantage d'être non invasive et non perturbante pour la cellule.

Cette technique devrait très bientôt faire l'objet d'un transfert technologique. Des contacts ont été pris avec des partenaires industriels afin qu'elle soit développée.

Référence :

M. Martin, L. Canioni and L. Sarger. Measurements of the Complex Third Order Optical Susceptibility in a Collinear Pump Probe Experiment. Optics Letters 23, 1874 (1998).

MICROSCOPE À GÉNÉRATION DE TROISIÈME HARMONIQUE
Le principe de ce microscope est le suivant. Le faisceau laser est focalisé sur l'échantillon suivant l'axe z. Le signal de troisième harmonique généré au point focal z0 (col du faisceau) est mesuré à l'aide d'un photomultiplicateur. La résolution axiale dépend de la focale de l'objectif utilisé et peut atteindre 0,5 µm. En déplaçant le faisceau laser dans le plan XY de l'objet, on peut reconstituer point par point une image 2D d'une coupe en z0 de l'objet. En changeant z0 (le point de focalisation), et en balayant à nouveau le plan XY, on reconstitue ainsi en 3D l'objet.
© CNRS-CPMOH. Microscope à génération de troisième harmonique : schéma de principe.		Figure 2 : a) image (15 µm x 40 µm) par génération de troisième harmonique d'une partie d'une cellule gliale dans une solution tampon avant injection de thapsigargine. b) Évolution en fonction du temps de l'intensité de la troisième harmonique en deux points de la cellule correspondant aux effets dépendant du calcium à l'intérieur de la membrane de la cellule gliale a).

¹ CNRS-Université Bordeaux 1. Ces travaux ont été réalisésen collaboration avec Pierre Voisin (Laboratoire "Résonance magnétique dessystèmes biologiques",CNRS-Université Bordeaux 2) et Pierre Vacher (Laboratoirede neurophysiologie,CNRS-Université Bordeaux 2), notamment pour les étudessur les cellules gliales.

* L'expression "troisième harmonique" vient du fait que pour une longueur d'onde initiale (fondamentale), on génère la longueur d'onde trois fois plus petite. On obtient donc une fréquence trois fois plus importante. En musique, la note, par exemple un "la", est la fréquence du fondamental et les harmoniques permettent de faire la distinction entre le "la" d'un piano et le "la" d'une guitare et donnent plus de richesse au son. En électronique, un ampli peut générer des harmoniques si, à partir d'un signal à une fréquence, on génère d'autres fréquences.